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实验研究FSH对体外培养支持细胞的DDX4和TPX1表达情况的影响,为深入研究体外精子发生提供理论和实践依据。以培养的犊牛支持细胞为实验材料,共以不同浓度FSH(0、0.01、0.02、0.04、0.08IU/mL)处理支持细胞,3个时间点的DDX4和TPX1的表达情况通过Realtime-PCR被检测。下面具体来了解一下！FSH对体外培养犊牛支持细胞DDX4和TPX1基因表达的影响。
支持细胞间的紧密连接形成血睾屏障，血睾屏障又将精细管的生精上皮分为基底小室和近腔小室两个部分，由于两个小室之间拥有不同的微环境，所以可以影响不同阶段的生精细胞发育，基底小室完成生精过程的启动阶段，内含精原细胞和细线期的精母细胞，近腔区靠近精细管的管腔一端，完成减数分裂使生精细胞向成熟精子变形，其中有正在发育的生精细胞和精子细胞。另外，FSH和睾酮等激素通过支持细胞对调节精子发生起到重要作用。DDX4和TPX1是生精细胞产生，他们均是精子发生的必要蛋白。关于他们是否在支持细胞表达还鲜有报道。
本实验体外培养支持细胞，通过FSH的作用，探讨几种与精子发生作用的重要基因变化，即DDX4和TPX1，为体外精子发生研究提供理论和实践依据。
1、材料
犊牛睾丸来双城市屠宰场，4h内运送回实验室．DMEM(Gibco)；PBS(Solarbio)；乙二胺四乙酸二钠(Amresco)；胰蛋白酶(1：250，Amresco)；FSH（宁波第二激素厂）；Trizol试剂（哈尔滨英俊生物技术有限公司）；FastStartUniversalSYBRGreenMaster(Rox)（德国罗氏公司）；EasyTaq酶、PrimeSTARHS(Premix)、DNAMarker、dNTP、oligodT引物、各种内切酶和RNaseInhibitor(宝生物工程(大连)有限公司）；ImPromIIreversetranscriptase（Promega公司）；2×TaqPCRMasterMix(北京天根公司)。
2、方法
2..1支持细胞制备
犊牛睾丸组织为试验材料，利用胶原酶和胰酶的组合酶法将其解离成单细胞悬液，并采用差速贴壁法纯化支持细胞后进行体外培养，支持细胞纯度大于95%。
2..2FSH处理支持细胞
解冻并培养支持细胞，初始细胞密度为3．O×10-4个／mL。将不同浓度FSH随机分为五组，A组，0.OlIU／mLFSH;B组，0.02IU／mLFSH;C组，0.04IU／mLFSH;D组，0.08IU/mLFSH,CK组(Controlcheck)OIU/mLFSH.
2..3细胞收集
以3．O×104个／mL的密度将支持细胞接种到多个6孔板，将细胞孔分为五组，每组9孔细胞。6h细胞贴壁后分别更换为5种不同浓度FSH培养基，空白组更换为全培养基，并以此时记做Oh。在6h、12h、24h时，分别向各组3个待测孔加1mLTrizol，吹打数次，收集细胞移入1.5mLEP管中，-80℃保存。
2..4DDX4和TPX1基因的相对定量
根据Trizol说明书提取各组细胞总RNA。总RNA经检测分析合格后进行反转录。反转录按照PromegaImpromII(Promega，Madison，WI，USA)试剂盒说明书两步法进行操作。为了检测FSH对基因表达的调节能力，通过RealtimePCR测定DDX4和TPX1的表达量，应用引物序列见表1。引物均由北京华大基因生物技术有限公司合成。
3、讨论与分析
3.1
FSH对支持细胞中DDX4基因表达的影响
DDX4基因为哺乳动物生殖细胞特异表达基因，与精子发生减数分裂密切相关，从减数分裂前就开始表达，在DDX4基因被敲除的纯合突变小鼠中，精子发生受阻于第一次减数分裂前期的偶线期，细胞凋亡，不能产生精子，显然在小鼠精子发生中偶线期的顺利完成有赖于DDX4基因的表达。实验检测FSH处理后支持细胞中DDX4基因mRNA表达量，结果一定浓度的FSH能够促进DDX4基因mRNA的表达增加。同时，支持细胞的紧密连接将曲细精管的基底区和近腔区处于不同的微环境中，近腔区是经减数分裂产生单倍体细胞，所以支持细胞有可能够通过FSH作用产生DDX4参加减数分裂促进精子发生，并且DDX4可能是近腔区微环境中的减数分裂因子。
3.2FSH对支持细胞中TPX1基因表达的影响
TPX1是在雄性生殖道中特异性表达的富含半胱氨酸的分泌蛋白，在睾丸特异性表达，有关于TPX1生物特性报道指出，TPX1的mRNA在生精细胞粗线期精母细胞有表达，并持续表达到成形精子形成，同时TPX1蛋白也持续进行表达，TPX1可以做为精母细胞和其他防治细胞功能联系的分子桥梁。本实验表明不同浓度的FSH处理支持细胞后TPX1表达量均显著提高，推测支持细胞产生的TPX1参与支持细胞与生精细胞的连接和功能传递，并进一步影响精子的发生。
4、结论
在一定浓度范围内，FSH显著促进DDX4、TPX1基因的表达，DDX4在12h左右表达量最高，TPX1在24h左右表达量最高。
相关知识
代乳粉对早期断奶犊牛生长及健康的影响
犊牛的培育是奶牛养殖业的关键环节，加强犊牛培育是提高牛群质量和生产水平的一项重要措施。我国大多数养殖场在犊牛培育上采用传统的养殖模式，即用鲜牛奶饲喂犊牛，一般犊牛自出生到断奶约需要消耗牛奶350～450kg，占奶牛年产奶量的5%～10%，由于鲜奶市场供不应求，用鲜奶培育犊牛成本高昂，因此很多养殖场选用病牛奶、抗生素奶饲喂犊牛，但这样又会导致犊牛感染疾病或对抗生素产生抗药性。近年来，世界各国对奶牛代乳粉开展了广泛的研究，用代乳粉饲喂犊牛，犊牛采食代乳粉，不仅可以早期断奶，而且可以产生一系列的积极效应，如节省鲜牛奶、降低饲养成本、促进犊牛消化器官的发育等等。奥氏代乳粉是根据犊牛的消化特点设计的，它以优质的植物蛋白为载体，配以充足的维生素和微量元素以及血球蛋白粉、低聚糖等免疫因子，经特殊加工工艺制成。为验证代乳粉的实际饲喂效果，特进行本次试验。
1试验材料与方法
本试验2008年3月～2008年5月在银川市平吉堡奶牛原种繁育场进行。
1.1试验材料
1.2试验动物的选择
1.3试验动物的饲养
将30头犊牛随机分组，独笼饲养，犊牛出生3d内饲喂全初乳，3～7d饲喂常乳。试验组8～30日龄开始添加饲喂一定比例的奥氏犊牛代乳粉（饲养方法见表3），对照组8～30日龄全部饲喂常乳6kg。通过对犊牛增重及发病情况的记录，计算出每头牛的日增重和净增重以及每组犊牛的平均日增重和发病率。将2组进行比较，看差异是否显著，如不显著，则说明代乳粉可有效代替常乳饲喂犊牛，并且不影响犊牛正常的生长发育。试验时间为30d。
1.4犊牛代乳粉的使用方法
1.4.1代乳粉的过渡
从喂初乳或牛奶向喂代乳粉过渡期为3～4d，避免突然改变日粮引起胃肠的不适应。方法是：第一天，代乳奶占1/4、牛奶3/4；第二、三天代乳奶和牛奶各占1/2；第四天代乳奶占3/4、牛奶占1/4；从第五天开始即全部喂代乳奶。
1.4.2代乳奶的配制方法
按1∶8的比例用60℃左右的温水冲调，但不可用开水，否则会使脂肪和蛋白质变性而致使犊牛难以消化，反而产生腹泻并降低犊牛的生长发育速度。
1.4.3代乳奶的饲喂方法
待混合好的代乳奶自然降温到37℃左右时，用小盆分发给每头犊牛，每天3次（做到定时，定温，定量），保证每头犊牛准确饲喂，不偏喂、少喂。
1.5试验牛的管理
试验牛从7日龄时开始训练采食精料（精料配方见表4），至30日龄1.5kg/d/头，必须保证充足的饮水。
1.6测定指标
犊牛出生重，30日龄体重，采食情况，精神状态，犊牛疾病发病情况等。
2结果与分析
2.1犊牛代乳粉对犊牛体增重的影响
试验开始对照组平均体重为39.4kg，试验组犊牛平均体重为39.6kg，试验组与对照组犊牛初生重差异不显著（p0.05）。经过30d的代乳粉饲养试验，对照组平均体重为56.6kg，试验组平均体重为59kg。由此可以看出，用营养平衡且完善的犊牛代乳粉代替常乳的确不影响犊牛的正常生长发育。经t检验，试验组与对照组差异不显著（p0.05），试验组比对照组平均体重多2.4kg，且试验组平均日增重比对照组要多0.071kg，这说明奥氏代乳粉能够有效代替常乳饲喂犊牛，易于消化，且有利于犊牛生长。
2.2犊牛的发病情况
在30d的试验期间，两组牛均发生拉稀现象，试验组3头与对照组4头犊牛发生腹泻，并无明显差异；试验组1头犊牛食欲不振是因为对代乳粉配制方法不熟悉和饲喂操作不规范所致；试验组2头犊牛和对照组1头犊牛发生感冒均属天气突变引起，与代乳粉无关。
2.3犊牛代乳粉对犊牛饲养经济效益的分析
由表6可以看出，试验组每头犊牛30d比对照组每头犊牛可节约人民币91.4元，按照试验组饲喂代乳粉0.75kg/d头、对照组饲喂常乳6kg/d头计算，预计到60日龄断奶可节约饲养成本248.9元/头，15头犊牛共节约了3733元。在当前奶价不断上涨的情况下，使用代乳粉势在必行，在保证犊牛正常生长发育的前提下可大大节约犊牛培育所需的成本，能够为企业获得更多的经济效益。
3结论
经过30d的饲喂试验，试验组犊牛比对照组犊牛平均日增重多0.071kg，这表明用配制营养完善的犊牛代乳粉完全可以替代鲜牛奶饲喂犊牛，犊牛代乳粉的确不影响犊牛的正常生长发育，而且在预防犊牛腹泻上效果良好，有利于犊牛的健康生长。
从经济效益分析的角度来看，进食代乳粉组犊牛比对照组到60日龄断奶可节约饲养成本248.9元/头（鲜奶按3元/kg计算）。以平吉堡奶牛原种场为例，共有成母牛550头，预计每年可产母犊300头，仅犊牛培育可节约饲养成本74670元。由此可见，奶牛养殖场利用犊牛代乳粉采取犊牛60日龄早期断奶势在必行，必然会为企业创造丰厚的效益。
投饵次数和投饵量对鳖饵料效率的影响
1、投饵次数和投饵量：习惯认为给鳖投饵应在上午8时左右，下午6时左右，2次为宜。主要理由是：
（1）鳖一般在上午日出后1～2小时到日落前喜到岸上晒背，这段时间不宜投饵。
（2）鳖虽具有夜间活动的本性，在自然界以夜间摄食为主，但在露天池中夜间温度低，还是在白天温度较高时投饵好。
（3）鳖喜静怕惊，人频繁出入池边对鳖是一种威胁，见人逃窜时会把饵料带到水中，造成浪费，再者考虑到劳动量，所以1天2次投饵是比较科学的。
鳖摄食量变化规律是：随着个体长大，单位体重的摄食量逐步减少，以人工配合饲料（干重）为例，在最适温度范围内，稚鳖阶段每天的投饵率为体重的6％～8％，幼鳖3％～5％，成（亲）鳖一般2％～3％即足够。每天饵料量的分配，一般为上午投喂总量的40％，下午投喂60％。
2、生长量与投饵量的修正：由于对鳖的摄食习性不了解，或者为了追求高生长率和产量，往往“投饵不足”或“投饵过量”。尤其是后者，不仅浪费了饵料，还会增加水质管理的难度和发病几率。从理论上讲，当饵料系数为3.0时，所产生的水质管理和发病率问题，将是饵料系数为2时的150％以上。可见寻求鳖的最好生长率和饵料效率之间最理想的平衡——最适投饵量，具有重要的实践意义。根据经验最适投饵量大致为鳖饱食量（一次正常投饵，鳖停止摄食前所能吃掉的饵料量）的90％左右为最适投饵量，这样不仅能使饵料效率得到充分发挥，也可以减轻水质管理难度和降低发病率等。
营养对奶牛产奶量和乳成分的影响
人们对牛奶品质的要求不断提高，因此奶牛场在提高产奶量的同时还要考虑改善牛奶的品质。奶牛饲料添加剂的研究也日趋增加，但多以微量元素和维生素以及瘤胃调节产品为主。如何提高奶牛日粮蛋白质的利用效益，减少氮的排放是提高奶牛养殖效益的重要手段。实际养殖生产中影响奶牛产奶量和乳成分的因素很多，主要有品种、环境、管理、营养、疾病、生理状况等。下面我们就一起来看看营养对奶牛产奶量和乳成分的具体影响！
1、碳水化合物
碳水化合物包括非纤维碳水化合物和纤维。其中非纤维碳水化合物包括淀粉、糖和果胶。在配制奶牛的日粮时非纤维碳水化合物占日粮于物质的比例应为20%-45%。此范围是根据日粮中精粗料的比例来确定，对于粗料含量较少的日粮，非纤维碳水化合物要求为40%～40%。饲喂适量的非纤维碳水化合物可以有效的改善牛奶的品质，不但可以提高乳脂率还可以提高乳蛋白率。如果过度饲喂则会使乳蛋白率和乳脂率都下降。因此每次饲喂谷物类饲料时要注意限制饲喂量，以防止发生瘤胃酸中毒、牛奶品质下降、奶牛食欲不良而引起产奶量下降的问题。
奶牛以采食粗饲料为主，因此纤维对奶牛的瘤胃健康、产奶量以及乳成分有着重要影响作用，纤维的含量可刺激瘤胃发酵和唾液的分泌，保持牛奶中正常的乳蛋白和乳脂肪量非常的重要。因此要保证奶牛日粮中最低酸性洗涤纤维为19%～21%，中性洗涤纤维最低为25%～28%，如果低于以上水平，则会导致奶牛出现乳脂率低、酸中毒、体况不佳。但是要注意粗纤维的比例也不宜太高，否则影响牛奶中乳蛋白的含量。一般要求饲喂400/～50%的粗饲料即可，如果粗饲料的饲喂量高于65%，则要选择优质的粗饲料，以免引起乳蛋白下降。除此之外，纤维的长度也很重要，要保证饲料足够的粒度，不可切的过短，或粉的过细，牧草不应短于1cm，否则会引起乳脂率的急剧下降。
2、蛋白质
奶牛的产奶量是随着日粮中粗蛋白含量的增加而增加的，高产奶牛对蛋白质的需要量超过了瘤胃蛋白质的合成量。因此，有的养殖场在养殖高产奶牛时，在泌乳早期会提高日粮中粗蛋白质含量至17.5%，这其中过瘤胃蛋白的量占35%-37%。但是奶牛的产奶量也并不是无限增加的，如在使用棉籽作为粗蛋白质的补充物时，随着日粮中粗蛋白含量的增加，产奶量和乳脂率增加，当粗蛋白含量超过17.5%以后，产奶量几乎就不再增加。另外，蛋白质补充物的添加形式不同，产奶量和乳脂率也不同。例如，使用压碎的大豆可提高乳脂率，而使用大豆粕可以提高产奶量，而乳脂率不受影响。奶牛日粮中可降解蛋白和过瘤胃蛋白的量对于产奶量和乳成分有重要的影响作用。一般要求瘤胃可降解蛋白和过瘤胃蛋白应占日粮中总蛋白质的65%，如果过少会降低产奶量和牛奶中营养物质的含量。过瘤胃蛋白的营养作用对于提高奶牛的产奶量和乳成分很重要，但是在添加时要注意所添加的过瘤胃蛋白质所含有的氨基酸是否能与机体所缺的氨基酸匹配，否则即使增加了饲料中过瘤胃蛋白质的量，但是由于机体所需的氨基酸增加量不多，或者根本没有增加，也不会起到提高产奶量和乳成分的作用。
3、脂肪
对于高产奶牛来说在泌乳初期和中期会出现能量负平衡的现象，能量很难满足奶牛的需求，此时为了提高日粮中的能量水平，同时还不减少日粮中纤维浓度的情况下，可以采用添加脂肪的方式来提高日粮的能量浓度。这是因为脂肪可降低微生物的活性以及纤维素的消化率，所添加过瘤胃保持脂肪或惰性脂肪在瘤胃内不发生水解可直接进入小肠被消化吸收，因此，既可以起到提供能量的作用，也可避免影响其他营养物质的消化吸收。有研究表明，日粮中添加脂肪可以提高产奶量，但是乳蛋白率会降低，而添加植物性脂肪会降低乳脂率，添加惰性脂肪和过瘤胃保护脂肪则会提高乳脂率。
4、添加剂
实际生产中常使用一些饲料添加剂来提高奶牛的产奶量和改善乳成分。常使用的添加剂主要有保值性氨基酸。研究表明，日粮中添加保护性的蛋氨酸和赖氨酸可以提高乳蛋白，并且两者同时添加的效果要比单一添加好。
缓冲剂的添加可以缓冲高精日粮导致的瘤胃酸增多，尤其是对于高产奶牛来说，当饲喂低纤维、高谷物日粮时，添加缓冲剂可以提高产奶量和乳脂率。生产上常用的缓冲剂主要有碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化镁、膨润土等。
乙酸钠。乙酸是合成乳脂的主要成分，而粗纤维在瘤胃中降解会产生乙酸，这就是饲喂粗料型日粮的奶牛所产的牛奶中乳脂率高的主要原因。而对于高产奶牛来说，为了保持能量的摄入水平，粗饲料的饲喂量要相对的少一些，可通过添加乙酸钠的方式来起到提高乳脂率的作用。另外，乙酸钠的添加还对高温热应激起到一定的缓冲作用。
另外，一些微量元素的添加，如铜、锌、硒、碘的添加可以提高奶牛的产奶性能，对于提高乳蛋白、乳脂率也有一定的作用。