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随着胚胎工程技术的深入研究和商业化推广应用，牛卵母细胞体外成熟、体外受精技术成为解决体外生产胚胎紧缺问题的重要途径之一。本研究在总结前人研究的基础上，应用体外培养技术对牛卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎体外发育作了进一步研究，旨在建立健全一套完整的体外生产高产优质牛胚胎的高新技术体系，为胚胎工程和生产实践提供技术操作规程和方法，为理论研究积累资料。下面就具体来了解一下：牛卵丘卵母细胞体外成熟的研究方法及进展。
牛卵丘母细胞体外成熟是在牛体外模拟卵泡环境，进而诱发未成熟卵母细胞成熟的一项生物技术。其是牛体外受精（IVF）的基础，也是重要环节之一，牛卵丘卵母细胞的体外成熟质量直接影响其体外受精效果，甚至是影响出生牛犊的质量。本文就牛卵丘卵母细胞体外成熟研究现状、研究方法、体外成熟的判定和存在问题等进行论述。
1、研究现状
有关专家于1935年利用兔卵泡中分离出来的卵丘卵母细胞进行体外培养，经成功减数分裂后，完成了兔卵丘卵母细胞的体外成熟过程。此后，哺乳动物的卵丘卵母细胞体外成熟培养技术得到了迅猛发展。目前，卵丘卵母细胞的体外成熟技术已被广泛应用于科学研究、医学生殖工程和畜牧生产中。牛未成熟卵母细胞经体外培养，体外成熟率可达90%以上。然而，体外成熟卵母细胞的质量和发育潜能与体内成熟的卵母细胞相比仍有较大差距，体外成熟的卵母细胞存在细胞质成熟差或者细胞核和细胞质成熟并不同步等问题。针对目前牛体外受精研究中出现的问题，有关专家认为，牛卵丘卵母细胞在成熟过程中退化以及细胞质不完全成熟是造成其体外受精胚胎生产效率低的主要原因。
2、研究方法及进展
2.1牛卵丘卵母细胞的获得
2.1.1从废弃的牛卵巢中获得
即运用切割法或抽吸法等机械分离法从屠宰场废弃的牛卵巢上获取未成熟的卵母细胞。将收集卵巢置于25～35℃的生理盐水中，添加抗生素，3小时内运回实验室。将术者的手和母牛的卵巢消毒后，将卵巢上多余的肉割掉，用装有18号针头的5毫升注射器，从卵巢表面直径为2～6毫米卵泡中抽取卵母细胞，也可用消毒的手术刀片切割卵巢，回收卵母细胞。
此方法中卵巢保存温度对卵母细胞的质量影响较大，此方法获得的卵母细胞成本低，但由于淘汰的牛大多无系谱，难以做到良种化。
2.1.2应用牛活体采卵技术采集卵丘卵母细胞
牛活体采卵技术是继牛体外受精、胚胎移植（ET）技术之后研究并推出的又一项胚胎工程技术。牛的活体采卵技术于90年代后期开始研究，2001年，活体采卵、体外受精的牛胚胎移植后成功获得犊牛出生。此项新技术与IVF及ET技术的配套综合利用，将更充分地挖掘优良母牛的遗传潜力，缩短牛的世代间隔，扩大遗传背景清楚、价格低廉的胚胎来源，从而加速养牛业的遗传改良。同时，也可为牛的基因工程研究提供大量的试验材料，以促进动物基因工程研究迅速发展。
2.2活体采卵的方法
活体采卵的方法主要有盲采法、内窥镜法和超声波法。
盲采法完全依赖操作者的经验进行，采集结果不稳定，回收率低，且对卵巢和阴道组织损伤比较大，延长了采卵间隔，降低了采卵频率，因此限制了该技术的应用。
内窥镜法可直观、准确地对卵泡进行穿刺，对卵巢损伤很小，但对阴道穹隆损伤比较大，且设备复杂，操作繁琐。
超声波法借助B超采集卵母细胞，是最主要的活体卵方法之一。
3、牛卵丘卵母细胞体外成熟培养
牛卵丘卵母细胞的体外成熟首次由某位外国研究者完成，但这仅限于核的成熟。牛卵丘卵母细胞体外成熟的胚胎发育潜能直到1978年才通过体内受精获得犊牛证实。1986年，有关专家报道了牛卵母细胞经体外成熟及体外受精获得的试管犊牛，进一步确证了体外成熟牛卵母细胞的可行性。
3.1成熟培养液
目前，用于牛卵丘卵母细胞体外成熟的基础培养液多为TCM199，也有的使用Ham’sF-10，MEM，TALP等培养液。
3.2培养液中的添加物
3.2.1血清
血清中含有蛋白质、维生素、脂肪、激素、氨基酸等营养物质和多肽类因子，是卵丘卵母细胞体外成熟与受精所必需的物质，能有效提高牛卵丘卵母细胞的体外成熟率。随着研究的深入，人们了解到血清除了可以提供卵巢上卵泡体外生长所必需的营养物质以外，也存在抑制卵泡生长的因素。因此，近年来研究用牛血清白蛋白或白蛋白来代替血清添加到基础培养液中，起到很好的培养效果。
3.2.2激素
目前，绝大多数研究者在牛卵丘卵母细胞的体外成熟培养中添加促性腺激素或类固醇激素或两者的混合物，结果都对卵母细胞成熟起到了促进作用。培养液中添加激素能够刺激腔前卵泡的生长及腔的形成，并且抑制颗粒细胞的凋亡，而在无激素的培养液中卵母细胞成熟率显著降低，且退化量大大增加。
3.2.3生长因子
基础培养基中添加各种生长因子和细胞因子，如胰岛素、表皮生长因子、胰岛素生长因子、白血病抑制因子、转化生长因子等，对卵母细胞的生长、成熟可起到重要的调节作用。生产因子是卵母细胞成熟的诱导剂，能促进牛卵丘卵母细胞的体外成熟。
3.2.4卵泡液
卵泡液能够提高成熟卵母细胞质的质量，同时，控制卵泡液在培养液中的添加浓度，可以消除其对核成熟的抑制作用。有研究表明，卵泡液对核成熟的抑制作用与所采卵泡的大小有关。来自小卵泡（小于3毫米）和中卵泡（3～8毫米）的卵泡液抑制卵母细胞核成熟，大卵泡液（大于8毫米）对核成熟没有抑制作用。
3.2.5卵丘细胞
卵丘细胞能够增加卵母细胞内谷胱甘肽（GSH）含量，GSH具有促进精子穿卵、雄原核形成及提高组蛋白H1活性等功能。在卵丘细胞与卵母细胞之间存在间隙连接，一些小分子物质如离子、核酸、氨基酸等可在两者之间交换，进而促进卵母细胞成熟，卵丘细胞能促进卵母细胞体外减数分裂的恢复，并且对发生GVBD后至排出PB1也起着重要作用。
3.2.6钙离子
细胞内Ca2+可以使无活性的促进因子，处于激活状态，进而促进卵母细胞的成熟分裂。
3.3培养条件
3.3.1气相条件
体外培养一般采用含5%CO2的空气，或5%CO2、5%O2、90%N2的气体。培养系统内CO2不仅可以平衡培养基，而且还有助于细胞代谢中的丙酮酸转换成草酰乙酸，有利于细胞成熟。
3.3.2温度条件
不同的温度对卵母细胞体外成熟的影响很大，过高或过低的温度均不利于卵母细胞的体外成熟。牛卵母细胞一般采用39℃进行体外培养。
3.3.3湿度
对于湿度的调节，一般需在CO2培养箱内放置调湿盘，以维持99%～100%的相对湿度，防止因培养液蒸发改变培养基成分的浓度，影响pH值和渗透压。
4、牛卵丘卵母细胞体外成熟的判定
牛卵丘卵母细胞的成熟是涉及细胞核、细胞质、膜、卵丘细胞和透明带等成熟的复杂生物学过程。在形态上表现为纺锤体形成，核仁致密化，染色质高度浓缩形成染色体，第一极体释放，细胞器重组，以及卵丘细胞扩展、膨胀、液化和透明带软化等。近年来研究者借助光镜和电镜逐渐揭示出这一生理生化过程的形态结构变化。由于仅有核成熟和卵丘细胞成熟能在光镜下进行判定，而对卵母细胞的综合成熟过程很难做一整体的具有生理学意义的评价，因而现在主要是以卵丘细胞扩散，并释放出第一极体作为卵母细胞体外培养成熟的判定标准。
5、存在问题与展望
经过人们大量研究与探讨，牛卵丘卵母细胞的体外成熟技术逐渐被掌握，并得到了不断提高，同时也存在诸多问题，如卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育阻滞，体外成熟卵母细胞的受精率较低，卵母细胞的成熟调控机理还不完全清楚等，但是，相信随着研究的不断深入，存在的问题会逐步被解决，同时，随着牛卵母细胞体外成熟技术的不断发展和完善，其必将推动牛体外受精技术的深入发展，并且，进一步促进核移植、外源基因导入和胚胎干细胞的研究，为促使牛胚胎操作技术的深入和牛体外受精胚胎商业化的普及，提供更有利研究和应用手段。
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1、宰前症状
病牛主要症状是精神萎顿，食欲不振或者停止采食，机体日渐消瘦，症状严重时体温会明显升高，往往可超过40℃，且持续较长时间。反刍减弱或者完全停止，四肢无力，行走不稳，且往往卧在地上，眼角膜潮红，并不停流泪，皮肤和可视黏膜苍白，发生黄染，腰背及四肢末端存在淤血。初期发生便秘，后期发生腹泻或者交替出现，排出混杂黏液或者呈血红色的粪便。血液稀薄，凝固不良。初期排出绿黄色或者浓黄色的尿液，频繁排尿，但不会排出血尿。发病后期，病牛眼睑、尾根等处形成不同大小的血斑，且发生血红蛋白尿，排出棕色或红棕色尿液。呼吸急促，心跳加速，生殖力能力降低。如果没有及时进行治疗，在发病后经过1～2月会发生死亡。妊娠母牛患病后容易发生流产、早产以及胎衣不下等。
2、宰后病变
病牛血液如水样稀薄，不容易凝固，伴有弥漫性血管炎。胸腹腔存在积液，淋巴结发生肿大。浆膜、黏膜发生黄染。肝脏明显肿大，达到正常大小的1～2倍，质地如泥样柔软，发生脂肪变性，并出现实质性炎性变化以及坏死。胆囊也发生肿大，含有质地浓稠的胆汁。脾脏发生肿大，被膜存在结节，结构不清晰。心脏、肺脏、肾脏发生程度不同的炎性变化。胃肠黏膜局部发生水肿。皮下组织以及肌间发生水肿、黄疸。
3、实验室检验
细菌培养。在无菌条件下，取病死牛的肝脏、肾脏、脾脏以及淋巴用于检查微生物，无论是涂片镜检还是接种培养，都没有发现细菌。
染色镜检。取耳尖血制成血液涂片，在室温下自然干燥后滴加几滴甲醇进行2～3min的固定，再添加足量的姬姆萨染色液进行30～60min染色，用清水清洗，吸干后进行镜检，能够在红细胞内看到圆形以及变形虫样的虫体。通过瑞氏染色，放在1000倍油镜下进行镜检，能够发现红细胞中有60%～70%发生变形，呈锯齿状、星芒状，且红细胞表面存在大量淡蓝色虫体，呈椭圆形、圆形、月牙状。
浓集法。也叫做离心血涂片法，即从病牛静脉处取1．OmL血液，添加2倍比例的1%盐酸，完全混合均匀后在500r／min的速度下进行5min离心，然后取上清液在2500r/min的速度下进行10min离心，取沉淀物使用pH值6.2的PBS液进行3次洗涤离心，接着稀释到0.5mL，用于涂片染色和压片法检查。该法具有较高的检出率。
碘制动试验。在病牛静脉处取一滴血液滴加在载玻片上，再添加等量的生理盐水进行稀释，然后使用显微镜观察。在看到作运动（如摆动、翻滚、扭转、下降、上升等）的附红体细胞时，滴加适量的0.1%碘溶液，就能够使其停止活动。之后使用生理盐水或者PBS液进行洗涤，发现附红细胞体无法恢复活动力，也没有被碘着色。这也是附红细胞体具有的能够用于与其他血液寄生病原微生物区别的特征，能够作为鉴别诊断的依据。
动物接种试验。取l头健康无病的牛（确保经过检验呈附红细胞体感染阴性）和3头病牛各2mL血液，都添加1000万IU青霉素和1000万IU链霉素，混合均匀后分别给2只2～3月龄健康兔（附红细胞体阴性）接种，进行2周的观察。发现兔接种病牛血液经过4天，表现出精神萎靡，被毛松乱，减少活动，经过7天进行血检，发现有虫体附着在红细胞表面，且大小、形态以及运动性都与以上病牛血片中所见一致，红细胞中有60%～80%发生感染，经过10天可视黏膜苍白，机体明显消瘦，红细胞中超过80%发生感染；兔接种健康牛血液后，没有表现出临床表现，进行血检也没有发现附红细胞体。
4、防治措施
药物治疗。病牛可使用贝尼尔、黄色素，并配合中药进行治疗，具有较好疗效。病牛可静脉注射由1500mL10%葡萄糖生理盐水、100mL5%黄色素、50mL10%维生素C组成的混合药液；取120g金银花，90g葛根，45g常山，90g柴胡，60g大白，30g苦参，120g生地，120g党参，60g元参，150g青蒿，30g甘草，加水煎煮后灌服，每天1剂。经过3天治疗，病牛症状逐渐好转，体温降低到正常水平，食欲有所恢复，此时要停止使用上述药物，改成在饲料中添加土霉素片混饲，每天2次，连续使用3天，然后随机抽血进行检查，如果没有发现附红细胞体，且精神、食欲恢复正常，全身症状消失，即表明痊愈。
加强饲养管理。牛舍加强卫生管理，保持干燥、通风良好，合理饲养。夏秋季节，要定期喷洒消毒药，用于将环境中生存的蜱消灭，避免其叮咬牛体。对于在牛体上寄生的蜱，要采取人工捕捉或者人工擦药、药浴，每天5～7次，以将圈舍内寄生的蜱完全消灭。
牛附红细胞体病的诊治
发病情况
河北省巨鹿县官厅镇张某饲养7头黄牛。2006年8月26日，一头8月龄的母牛发病，以后又有3头牛发病，主要表现为发热、腹泻、黄疸、贫血、消瘦等症状。当地兽医用青霉素、链霉素、安痛定治疗，不见疗效。最后全部发病，遂到邢台市兽医院诊治，经临床诊疗，剖检病变，实验室检验确诊为牛附红细胞体病。采取综合性的防治措施，只有第一头发病早的牛由于治疗不及时，抢救无效死亡。其他牛均治愈。
临床症状
病牛最初为食欲减少，反刍减弱，行走无力，双眼流泪，随着病情发展，病牛体温高达41℃左右，呈稽留热，呼吸加快，心律快，瘤胃蠕动音减弱，病牛出现便秘，继而腹泻，排出稀软或水样带血的粪便，尿量减少，尿中带血，眼结膜苍白。病牛逐渐消瘦，四肢无力。病后期体温下降至常温，可视黏膜苍白、黄疸，严重者卧地不起至死亡。
剖检病变
尸体消瘦，可视黏膜苍白；血液稀薄、色淡，凝固不良；皮下、浆膜下及全身脏器有出血点；腹水多呈淡黄色；肝肿大、边缘钝圆、质软，呈土黄色；胆囊肿大，充满胆汁；脾肿大出血，呈土黄色；心肌扩张、质软；皱胃及小肠黏膜呈弥漫性出血、水肿。
实验室检验
1.取抗凝血1滴于载玻片上，用等量的生理盐水稀释混匀，在600倍显微镜下镜检，红细胞呈月牙状、星芒状等多形性，细胞边缘附着球形、短杆状、星状和闪光状的小体，有的附着于红细胞表面，有的游离于血浆中摇摆游动。
2.采病牛的耳尖血涂片，（1）瑞氏染色，在1000倍油镜下镜检，可见70%左右的红细胞变形，呈锯齿状、星状，红细胞表面附有大量圆形、椭圆形、短杆状、月牙状等紫蓝色虫体，亮晶发光，最多的一个红细胞表面附有十几个虫体。一般为3个~7个，血浆中也有，但量少。（2）姬姆萨染色，镜检，红细胞呈粉红色，附红体呈淡蓝色，多数为半月状。
3.无菌操作，取病死牛的心血、肝、脾、肾、淋巴结涂片，革兰氏染色镜检未发现细菌。将以上病料接种于普通肉汤、普通琼脂、鲜血琼脂培养基中，未见细菌生长。
根据发病情况、临床症状、剖检病变和实验室诊断，确诊为牛附红细胞体病。
防治
1.加强饲养管理，搞好卫生消毒工作。
隔离病牛，圈舍及周围环境用绿威霸消毒液进行彻底消毒。用溴氢菊酯消灭吸血昆虫。
2.对病牛进行有效的治疗。（1）应用美达欣(主要成分为贝尼尔等)按每公斤体重0.1毫升，肌肉注射，两天1次，连用2次~3次。（2）肌肉注射红净（主要成分为土霉素），每公斤体重0.2毫升，每天1次，连用3天~5天。（3）病重牛辅助治疗：5%葡萄糖生理盐水1500毫升~2000毫升，10%葡萄糖酸钙100毫升~200毫升，10%碳酸氢钠100毫升，维生素B120毫升，维生素C20毫升，1次静脉滴注，上下午各1次，连用3天。（4）粪便、尿液呈潜血，1次肌肉注射止血敏20毫升。（5）饲草与饲料内混合0.05%四环素，连用3天，并增加多种维生素。通过采取以上综合性的防治措施，5天后除一头病情比较严重的牛死亡外，其他牛全部痊愈。
小结
1.本病通过临床症状、病理变化、实验室检验诊断为牛附红细胞体病，通过采取以上综合性的防治措施，使病牛很快康复。
2.牛附红细胞体病主要经过吸血昆虫传播，特别是夏秋季，是各种昆虫活动的高峰期，吸血昆虫叮咬，促使本病发生与流行。因此应加强饲养管理，饲喂全价饲料，增加多种维生素，增强机体的抗病力。消灭吸血昆虫，经常消毒，是预防本病的有效方法。
3.牛发病后，要早诊断，早治疗，不要错过最佳治疗时间，避免滥用药。选用特效药物，才能使疫情尽快得到控制。
兔球虫病诊断方法 兔球虫病防控的研究进展
兔球虫病是一种常见的寄生虫病，目前尚未研制出兔球虫疫苗，国内外防治兔球虫病的主要方法仍然是应用抗球虫药。南于兔球虫对各种化学性抗虫药很容易产生抗药性，且不同地区球虫株之间存在差异，患兔生长发育受阻，体重可减轻12％～29％，死亡率高达80％以上，造成经济损失大。下面具体来了解一下：兔球虫病诊断方法兔球虫病防控的研究进展。
1、常规诊断
实验室诊断一般根据季节因素、环境、年龄、临床症状和病理剖检后的典型病变可进行初步诊断。确诊需进行实验室检查，常用饱和食盐水浮集法和直接抹片法对粪便进行检查，值得注意的是，当患急性兔球虫病时，粪便检查往往会看不到卵囊，则必须进行病例剖解。可取肝脏和小肠坏死灶，进行镜检，观察是否有椭圆形卵囊或透明的呈香蕉型的裂殖子，如发现即可确诊为球虫病。如果要确诊感染球虫的种类，还需对球虫卵囊的寄生部位、孢子化时间、孢子化卵囊的大小、形态结构以及潜隐和致病性等特征进行研究，有时还需进行人工感染动物实验来确诊。在11种公认的兔球虫中，只有斯氏艾美耳球虫寄生在肝脏，具有高致病性，潜伏期为14天；黄艾美耳球虫和梨形艾美耳球虫寄生在大肠，其中黄艾美耳球虫寄生在盲肠近端和结肠，属于高致病性，梨形艾美耳球虫寄生在结肠，属于中度致病性，这两种球虫潜伏期均为9天；剩下八种分别寄生在小肠的结肠段、空肠、回肠、十二指肠以及肠道相关淋巴组织处，只有肠艾美耳球虫具有高致病性，潜伏期4.5-10天不等。
2、分子生物学诊断
Fernandez等人通过一组序列特征扩增区域标记技术作为艾美耳球虫属的特异性鉴定。Carvalho等人用20个卵囊就能准确的鉴定7种主要感染的艾美尔球。PCR作为常规的诊断技术可以有效的检测畜禽中艾美耳球虫的波动，对预防寄生虫方面减少了不必要的工作。Myung-JoYou采用多重PCR扩增ITS1序列，对柔嫩艾美耳球虫、堆形艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫进行诊断，仅Spg的DNA进行多重PCR就可以对艾美耳球虫属的球虫进行检测，因此多重ITS-PCR方法敏感度较高，只需要很少量的DNA样本即可。Yan等人对6种兔艾美耳球虫ITS进行扩增，并且应用多重PCR诊断方法，区分了三种高致病性艾美耳球虫。Oliveira等设计出11种兔艾美耳球虫的ITS1序列特异性引物，采用套式PCR方法，仅用500fg到1pg即能扩增出特性行条带。Khaled等人采用ITSlPCR扩增对兔艾美耳球虫感染进行早期诊断，结果显示，在感染球虫第15天，肝脏显示不规则黄白色病变，肠道上皮组织病理切片可以看见不同的裂殖体和配子体；第20-24天出现肝肿大和肝腹水病变；在感染的第12天肝组织PCR呈阳性，粪便样品是第18天呈阳性，血液样品呈阴性。PCR可以用来作为艾美耳球虫病的早期诊断方法，也可以在粪便卵囊脱落前检测到裂殖体。
分子生物学鉴定是一种准确、有效的早期诊断球虫病的方法。普通PCR方法可以有效鉴定7种主要球虫，并且只需要20个卵囊即可，而且操作简单、成本低，但是需要纯化才能测序，易出现假阳性。套式PCR单个卵囊即可检出，该方法敏感性好、特异性高，可以有效检测兔球虫的感染情况，但套式PCR方法费时，而且也易出现假阳性。而且PCR方法还可以作为兔球虫早期诊断的方法，可以在球虫对兔肝脏造成影响前做出有效诊断。很多病原检测采用到环介导等温扩增(LAMP)方法，LAMP方法特异性强、等温条件下灵敏度高、操作简单、易检测等特点，Christopher等采用LAMP方法对鸡球虫感染进行特异性检测，兔球虫未见用相关LAMP检查方法，但可以借鉴鸡球虫相关报道。
3、展望
兔球虫病对养兔业危害严重，关于球虫方面的研究也从未停止过。球虫感染多为混合感染，不同的艾美耳球虫潜伏期和感染部位不同，其危害也不相同。准确的诊断患病动物感染哪种球虫病，最好可以在未对动物造成严重伤害前做出早期诊断，可以更有效的控制球虫病。迄今为止，对球虫的防控研究主要还是集中在药物方面，
但是球虫极易对药物产生耐药性，也会有药物残留问题。因此对球虫病早期分子生物学诊断的相关研究应该加强、深入，可以为兔球虫病的防控提供高效的方法，从而更好的控制球虫病。
兔球虫病临床症状
根据球虫的寄生部位可分为肠型、肝型和混合型三种。开始时病兔食欲减退，精神沉郁，伏卧不动，生长停滞。眼鼻分泌物增多，体温升高，腹部胀大，臌气，下痢，肛门沾污，排粪频繁。肠球虫有顽固性下痢，甚至拉血痢，或便秘与腹泻交替发生。肝球虫病则肝脏肿大，肿区触诊疼痛，黏膜黄染。家兔球虫病的后期往往出现神经症状，四肢痉挛、麻痹，因极度衰竭而死亡。肠型死亡快，肝型较慢。
病理变化
肠型球虫病见十二指肠壁厚，内腔扩张，黏膜炎症。小肠内充满气体和大量微红色黏液，肠黏膜充血并有出血点。慢性者，肠黏膜呈灰色，有许多小而硬的白色小结节，内含有卵囊。肝球虫病则肝肿大，肝表面与实质内有白色或淡黄色的结节性病灶，取结节压碎镜检，可见到各个发育阶段的球虫。日久的病灶，其内容物变为粉粒样钙化物。剖检所见多数为肠球虫和肝球虫混合感染。
剖检
1、肠球虫急性死亡，肠壁血管出血、充血、十二指肠扩张、肥厚、粘膜、发炎、肿胀、充血、出血，小肠充气，内积红色粘液。慢性兔肠粘膜呈淡灰色，并有许多小而硬的白色结节和小的化脓性坏死病灶，肠系膜淋巴结肿大，膀胱积有黄色浑浊性尿液。膀胱粘膜脱落。
2、肝球虫，可见肝肿大，表面有数量不等和大小不一的白色或淡黄色结节，呈圆形，如栗粒，大至豌豆，沿小胆管分布。慢性者胆管周围和肝小叶间的结缔组织增生，使肝细胞萎缩，肝脏体积缩小，肝硬化。胆囊粘膜发炎充满浓稠色淡的胆汁，腹腔积液等。
3、肝、肠混合感染，其两种病变都有，并且显现轻、重或多、少之分，无疑给诊断带来困难，同时易混淆或误诊，实践证明，球虫病最易与大肠杆菌、魏氏梭菌、肝片吸虫、拴尾蚴虫等混合感染，尤以大肠杆菌为甚，因此，应做好类症鉴别，依症辨别，综合分析，对症论病，最后确诊，再采取有效措施预防和治疗。
诊断
1、根据流行病学、临床症状和病理变化可做出初步诊断，确诊需进一步做实验室诊断。
2、实验室诊断
镜检卵囊可采取肠黏膜的白色小结节、肝脏的白色结节压片检查，或取粪便直接涂片检查，必要时采取粪便用饱和盐水漂浮法检查卵囊。
给药方式
目前球虫药的使用方式分为【注射】，【混饮】，【混粮】，【直接口服】以及【含有球虫药的兔饲料】，这五种最常见的形式。
一，注射方式
给药方式：皮下注射，通过将【针剂球虫药】注射到皮下后缓慢吸收而达到预防的效果。
优点：给药剂量准确，摄入量有保证，效果确切。
缺点：需要注射比较麻烦，兔子有疼痛感。
二，直接口服方式
给药方式：经口喂服，通过将【可直接口服的水剂球虫药】直接喂到兔子口中吞咽吸收而达到预防的效果。
优点：给药剂量准确，摄入量有保证，效果确切。
缺点：需要喂药比较麻烦，导致兔子生气，或喂药者被咬，或兔子喂药时受伤。
三，混饮方式
给药方式：将【水剂球虫药】按照一定比例与饮水混合后【让兔子自由饮用】而达到预防的效果。
优点：不需要打针，不需要专门喂药，省事。
缺点：很多兔子饮水量偏小导致药物摄入不足，或饮水中加了球虫药有异味兔子不喝，最终导致预防球虫病失败。
四，混粮方式
给药方式：将【粉剂球虫药】按照一定比例与兔粮混合后【让兔子自由食用】而达到预防的效果。
优点：不需要打针，不需要专门喂药，省事。
缺点：药粉附着性差，很难与兔饲料充分混合并全部附着于兔饲料表面，并且很多幼兔吃食不规律，或兔饲料中加了球虫药有异味兔子不爱吃导致药物摄入不足，最终导致预防球虫病失败。
五，喂含有球虫药的兔饲料
给药方式：兔饲料生产者将球虫药预置于兔粮中，兔子通过吃食间接摄入球虫药而达到预防的效果。
优点：不需要打针，不需要专门喂药，省事。
缺点：兔饲料适口性如果不好，就会导致药物摄入不足，最终导致预防球虫病失败。
六，需要重视球虫药带来的肠道刺激
症状：有一些兔子使用球虫药后，粪便发生异常，例如大小不一，甚至出现水样便。
解决：每天喂服益生菌类药物来维持兔子肠道菌群正常状态，例如乳酶生片。
七，必须重视过量使用球虫药导致的中毒。
症状：一些人擅自加大球虫药的使用量导致兔子球虫药中毒。
解决：严格按照产品说明书所标示的使用方法，使用剂量来使用。一旦发生药物中毒，只能用过加快体内代谢的方式解毒，例如喂大量的饮水，或输液（每公斤体重10毫升），并辅以常规解毒方式，例如注射维生素C，注射强力解毒敏。
防治
加强兔场管理，成年兔和小兔分开饲养，断乳后的幼兔要立即分群，单独饲养。保证饲料新鲜及清洁卫生，饲料应避免粪便污染，每天清扫兔笼及运动场上的粪便，定期消毒。
可采用莫能霉素等药物预防本病发生。发现病兔立即隔离治疗。治疗药物可用磺胺甲氧嘧啶、呋喃唑酮等。
发现病兔应按《中华人民共和国动物防疫法》规定，采取严格控制、扑灭措施，防止扩散。病兔应隔离、治疗或扑杀，病死兔的尸体、内脏等应深埋或焚烧。兔笼、用具等应严格消毒，兔粪堆积发酵。消灭兔场内的鼠类、蝇类及其他昆虫。
1、兔舍建筑应选择向阳、干燥的地方，并要保持环境的清洁卫生。
2、食具要勤清洗消毒，兔笼尤其是笼底板要定期用火焰消毒，以杀死卵囊。
3、断奶以后至3月龄的兔应用药物控制球虫病的发生，且不分季节。为防止产生抗药性，可采用几种抗球虫药物轮换使用。
常用预防球虫病的药物及用法：
兔球速杀广谱类粉剂抗球虫药，以每百公斤饲料混药100克饲喂。
氯羟吡啶以每百公斤饲料混药20克-25克饲喂。（效果不明显）
氯苯胍每日每公斤体重15毫克拌料。（一般会产生耐药性）
上述药物也可用于治疗，一般用预防剂量的2-3倍，毒性强的药物除外。不完全喂料时应在料中增加用药量。在众多抗球虫药中，含有马杜霉素的各种剂型的药，不能用于兔，否则会发生中毒死亡。
牙鲆营养需要量的研究进展
牙鲆属鲽形目，鲽亚目，鲆科，牙鲆属，是鲽形目中一种底栖肉食性鱼类，我国仅有牙鲆一种，沿海均产之，黄海、渤海产量较多，由于其肉质嫩、味道鲜美、营养丰富，深受人们喜爱，市场需求旺盛，经济价值较高(张辉等，1998；李爱杰等，2001；魏万全等，2001)，成为海产鱼类中重要的捕捞对象。与此同时，诸多不利因素如环境污染、病害频发等严重制约着其发展。另外，牙鲆营养特别是仔稚鱼的营养与饲料问题较突出，高效优质的人工配合饵料还没有开发出来，很多养殖单位育苗时不得不依靠进口饲料。我们将牙鲆对蛋白质、脂类和维生素等物质的需要量进行的调查介绍如下，为牙鲆人工饲料的开发提供参考。
1 蛋白质和氨基酸需要量
1．1 蛋白质 蛋白质不仅为牙鲆生长所必需，而且作为主要的能源物质，对保证其能量供应有着尤为重要的意义(张辉等，1998)。牙鲆属肉食性鱼类，对蛋白质的需要量较其他鱼类高(王吉桥等，2000)。李爱杰等(2001)发现，当牙鲆幼鱼饲料中蛋白质含量为52．78％时，鱼体增重率最高，而在蛋白质含量为57．35％时，增重率明显下降。菊池弘太郎用白鱼粉和小麦粉作为饵料蛋白源饲养牙鲆，结果发现，增重率和饵料系数在任何发育阶段都随饵料蛋白质含量的增加而上升。由此可见，牙鲆饲料蛋白质的需要量应为48％~58％。 由于牙鲆对蛋白质的需要量很高，饲料中白鱼粉用量很大，饲料成本较高，所以从成本和经济角度考虑，寻找合适的替代蛋白源受到人们的重视。其中北洋鱼粉和乌贼分别作为饵料蛋白源时，鱼增重、饲料转化率和蛋白质效率比最高，大豆次之，羽毛粉和卵蛋白粉最差(菊池弘太郎，1993；Kikuchik，1994)。Yamamoto用麦芽蛋白粉(MPE)代替鱼粉蛋白源投喂牙鲆幼鱼，结果发现，麦芽蛋白粉为10．4％的饵料与对照组的增重、饲料利用率差别不大，麦芽蛋白粉含量再增加，上述参数变化明显。Kikuchi用羽毛粉作蛋白源，当含量在12％时，牙鲆体重、蛋白质利用率均略高于对照组，而饲料转化率较低。
1．2 氨基酸 饲料中必需氨基酸的适宜比例能反映饲料及其蛋白质的质量。一般情况下，必需氨基酸与饲料蛋白质含量呈正相关，但蛋白质含量相同的饲料，由于蛋白源不同，必需氨基酸的含量和比例可能差异很大。因此，饲料中必需氨基酸的适宜含量和比例对动物的生长发育要比饲料中蛋白质的适宜含量更加重要(刘焕亮，2002)。日本中央水产研究所在1991～1996年将天然牙鲆和人工养殖牙鲆肌肉中的游离氨基酸作了比较，结果有很大差别，天然牙鲆肌肉中牛磺酸的含量比人工苗种明显高，而人工苗种中丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和非必需氨基酸含量比天然牙鲆高，经研究表明肌肉中氨基酸组成不同是因饵料质量不同引起的。
2 脂肪和脂肪酸需要量
2.1 脂肪 脂肪是一种容易利用的能量形式，不仅可以提供必需脂肪酸，提高饲料转化率，改善饲料适口性，同时也是脂溶性维生素的溶解介质。山本修报道，牙鲆饵料中脂肪适宜含量，稚鱼期7％，育成期10％~13％，出池前14％。
2．2 脂肪酸 近年来大量研究表明，n-3系列高度不饱和脂肪酸(n-3HUFA)是海水仔、稚、幼鱼的必需脂肪酸。仔、稚鱼自身不能合成这些必需脂肪酸，只能从饵料中摄取。饵料中n-3HUFA的数量和种类直接影响海水仔、稚、幼鱼的生长和成活，其中以二十六碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)最为重要，如果必需脂肪酸不足或比例不合适会引起各种疾病(Yamamoto等，1992；Miki等，1990)。牙鲆对必需脂肪酸的需要量为18-35 g／kg饲料(hquierdo等，1992)。许多研究表明，缺乏n-3HUFA或缺少EPA和DHA二者之一的饲料都有可能导致鱼体生长缓慢、食欲不振、死亡率高。在饵料中添加DHA可以改善鱼类生长、存活(Sargent等，1999)。张显娟的试验研究表明，投喂不含EPA和DHA的饲料，牙鲆鱼体极为瘦弱，添加0．5％EPA、1．5％DHA组生长最好，增重率为119．67％，其次是EPA 0．5％、DHAl。0％组增重率为113．31％。鱼体快速生长时，常表现出鱼体总脂含量的增加和水分含量的下降，在投喂不含EPA和DHA的饲料1周后，鱼体水分由80．12％升至84．72％，脂肪含量由20．36％降至15．73％，表明牙鲆对饲料中必需脂肪酸的含量极为敏感。Izquierdo等在饵料中添加3％-5％HUFA，结果牙鲆生长良好，若在饲料中添加6％~9％HUFA则无明显效果。 目前主要采用活饵料和配制人工饲料两种方式给鱼提供必需脂肪酸。刚开口摄食的海水鱼苗消化系统不完善，不能合成各种消化酶，必须依靠强化活饵料(轮虫和卤虫等)，利用活饵体内的消化酶来消化食物并提供必需脂肪酸。强化活饵料的实质是利用活饵身体携带、活饵消化道内充塞和体内合成与转化等方式来提供必需脂肪酸(王吉桥等，2001)。用球形等鞭金藻强化的轮虫喂欧洲的一种牙鲆(Paralichthys dentatus)，生长快，成活率高，体色正常率高(Baker等，1998)。Izquierdo报道，投喂n-3HUFA含量3．5％-4％的卤虫，仔鱼的全长和体重明显增加，另外在仔鱼的中性和极性脂肪中发现不少22: 5n-3，它在牙鲆仔鱼的脂肪代谢中起重要作用。 用富含n-3HUFA的油脂强化活饵的主要问题之一是强化剂在充气条件下极易氧化，通常采用添加天然或(和)人工抗氧化剂(如维生素E、维生素C、乙氧基喹啉和丁化羟基苯甲酸等)的方法来延长强化时间(Mcevoy等，1995)。鱼类对n-3HUFA的需要量越高，强化过程中抗氧化剂的添加量就越高。卵磷脂既是天然乳化剂，又是抗氧化剂，在富含22：6n-3的鱼油中添加10％卵磷脂，就无需添加其他抗氧化剂。鱼卵卵磷脂优于大豆卵磷脂，对体重7.84g的牙鲆的喂养试验表明，大豆卵磷脂的营养价值比油菜籽卵磷脂和鸡蛋卵磷脂高。
3 维生素需要量
维生素为鱼的生长和健康所必需，对鱼体内新陈代谢过程具有至关重要的调节作用。鱼的维生素需要量很少，但自身不能合成，必须从食物中摄取，缺乏时会出现维生素缺乏症。山本刚史报道，用维生素强化的轮虫投喂牙鲆，对变态的白化现象有一定抑制作用。三木教力报道，每升轮虫培养水中投入维生素A、D、E分别为15、0．625和20mg／L时，白仔的防除效果比较明显。 维生素A、D、K对牙鲆的体长、体重增长有影响，牙鲆维生素A、D的适宜量为8780、2480 IU／kg，维生素K为11．7mg／kg饲料。当维生素E含量为186mg／kg饲料时，对防除牙鲆无眼侧出现的体色异常(黑化)是有效的。在牙鲆饲料中添加生物素，其增重率有明显提高，适宜需要量为1．91 mg／kg饲料。添加不同剂量的叶酸虽对其增重影响不大，但有一定影响，其适宜量为1．91mg／kg饲料(张道波，1999)。在饲喂牙鲆幼体时，饲料中维生素C添加量为400 mg／kg饲料时，牙鲆成活率有一定提高，其增重也有显著提高；而对于牙鲆成鱼的体重增长率、维生素C在肝脏中的含量变化和碱性磷酸酶活性观察，维生素C的适宜添加量应为600-800mg／kg饲料，该水平未考虑牙鲆所处的恶劣环境条件以及疾病等负面因素，在实际生产中维生素C的需要量可能会大大增加。对于容易溶失的维生素B3，中国农科院研究出了水不溶性的维生素B3，试验表明，水溶性的维生素B3适宜添加量为60mg／kg饲料，而使用水不溶性的维生素B，饲喂牙鲆，其适宜添加量为45mg／kg饲料(张道波，1999、2001)。
4 碳水化合物和激素需要量
4．1 碳水化合物 碳水化合物不仅是一种能源物质，可节约蛋白源，也是饲料中的粘合剂。肉食性鱼类对碳水化合物的需求不高，一般不会高于饵料30％(刘焕亮，2002)。李爱杰研究表明，当饲料中碳水化合物为15．80％、脂肪8．78％时，牙鲆幼鱼的增重率最高。
4.2 激素 甲状腺激素在鱼类早期发育阶段有着重要作用，对仔鱼的生长、发育、变态等都有一定的影响(张臻字等，1999)。Inui和Miwa等(1985)发现，牙鲆仔鱼向稚鱼变态的过程中，甲状腺激素和肾上腺激素有骤然升高的现象，而变态后又恢复较低水平。许多试验表明，外源甲状腺激素和皮质醇浸泡处理能影响仔鱼的发育。外源性生长素(GH)对鱼类可明显促进其快速生长。
5 矿物质元素需要量
李爱杰研究发现，幼鱼饲料中铁元素的适宜添加量为50mg／kg饲料，低于50mg／kg饲料时鱼体增重不明显，高于50mg／kg饲料时鱼体生长缓慢，而且牙鲆肝脏过氧化氢酶活性受到抑制。因此，为了保持鱼的正常生长，提高鱼体防御机能，同时预防饲料中其他成分对铁吸收和利用的不利影响，在牙鲆幼鱼饲料添加适量的铁是必需的，添加量以50mg／kg饲料为宜，饲料中铁的总含量应在373mg／kg饲料左右。以鱼粉为基础的试验饲料中如果不添加锌，鱼体增重率、肝脏锌含量、肠粘膜碱性磷酸酶的活性都低，当添加锌0~80mg／kg，这些指标随着锌添加量的增加而增大。因此，为了达到较大生长率和保持鱼体组织中正常锌水平及酶活性，牙鲆实用饲料中锌添加量应大于80mg／kg，锌的总含量应在119．2 mg／kg以上(魏万全等，1998、1999)。铜元素对于鱼体增重影响不大，但是在其含量为1．5-3．0mg／kg时，牙鲆肝脏铜锌超氧化物歧化酶活性显著提高，牙鲆幼鱼实用饲料中铜总量为5．6 mg／kg左右为宜。锰元素对于牙鲆生长也是必需的，当添加量为10 mg／kg时增重最快，增重率达159．4％，但添加30 mg／kg时增重率反而下降。对于钴元素，添加量为0．8mg／kg时幼鱼增重率最高。硒元素在0．4 mg／kg时鱼体重明显增加，但在0．8 mg／kg时鱼体重急速下降至最低点(魏万全等，1998、2001)。 综上所述，牙鲆幼鱼饲料中各种微量元素的适宜添加量分别为：铁50、锌80、锰10~20、铜1．5~3．0、钴0．8、硒0．4mg／kg。 6 结语 今后，牙鲆营养学研究的重点应为以下几个方面：
1)除了研究牙鲆生长所需各种营养物质的量外，还要研究各种营养物质的配比关系，以求营养物质作用达到最佳水平。
2)加强碳水化合物、激素和微量元素对牙鲆生长影响的研究。
3)研究各种营养物质的消化吸收与环境条件的影响，营养物质过剩产生的各种连锁反应。
4)微营养与免疫(抗病性)、激素(抗应激性)、环境(适应和污染)同水产品质量之间的关系。
围产期奶牛低钙血症防治方法的研究进展
1围产期奶牛低钙血症的研究介绍
围产期奶牛低钙血症主要特征为血钙的降低、平滑肌的收缩能力变弱，严重时可变为抑制排尿和排粪、昏迷甚至死亡。据2008年美国农业部发布的信息表明，2006年美国的奶牛发生乳热的比例为4.9%，由低血钙直接引起的乳热已经成为影响奶牛健康的五大类疾病之一。另外，亚临床型的低钙血症或乳热会提高围产期相关疾病的发病率，例如乳房炎、真胃变位、酮病、繁殖障碍等疾病。
2.常用的防治方法
在1925年发现了通过静脉注射钙剂来治疗该病的方法。到1968年研究者通过对奶牛注射维生索D类似物来预防低钙血症。现今，防治低钙血症的主要措施包括在围产期喂食阴离子盐日粮、在产前喂食低钙日粮、在产后对奶牛灌服大剂量的钙盐凝胶、缩短奶牛的干奶期以及降低产后奶牛初期的泌乳量等。
3常用方法的分析比较
3.1静脉注射钙剂
在我国常用的钙剂一般为30%的硼葡萄糖酸钙注射液，其优点是在葡萄糖酸钙在水中加入了硼，使其浓度由10%变到30%，提高了其单位体积药物里钙的含量，因此只需补充较少的药物就能达到预防或治疗的目的。但高浓度钙盐的静脉注射，易对静脉产生刺激，产生静脉炎，而且静脉易被针头刺破，当钙剂进入组织后会引起肌肉的坏死，同时针刺颈静脉也会对奶牛产生一定的应激。该方法并不适合农户自行操作，只能由专业人员进行治疗，因此使用上有诸多不便。
3.2喂食高浓度的钙盐凝胶
该方法克服了静脉注射产生的应激、引起静脉炎、肌肉的坏死等缺点，但由于高离子浓度的钙及相关的负离子会对奶牛在消化道黏膜上产生刺激作用，容易造成黏膜的损伤、脱落，影响奶牛的采食量。
3.3围产前期喂食阴离子盐型的日粮
产前要喂食适宜阴阳离子差的日粮，能够诱甲状旁腺激素(PTH)的分泌，促进血钙的转化，对低钙血症的预防有一定的作用。但阴离子盐型的日粮口感差，可降低奶牛干物质的摄人量，引起能量的负平衡，这也是引起奶牛酮病的原因。
3.4产前喂食低钙日粮
通过在奶牛产前喂食低钙的日粮，可以诱导币状旁腺促进分泌PTH，进而促进骨钙转变为血钙的过程，但是研究表明仅当每天吸收的钙小于20g的时候才能产生效果，但是现在的措施很难实现这一条件，昕以喂食低钙日粮对其的诱导效果并不明显。
3.5PTH在产前的注射
因为PTH的生物合成并没有达到商业化，所以该方法的成本仍然很高，不利于推广。而且PTH的有效使用剂量接近于中毒的剂量，使用时极易发生奶牛的中毒。因此，该方法一般只在国外少量的牛场进行研究性质的应用，未被进行大范围的推广。
3.6在产后口服氨基酸螯合钙
氨基酸螫合钙类的制剂被广泛的应用于人体的补钙过程中，对预防及治疗老年性的骨质疏松以及孕妇围产期的缺钙具有良好的作用。氨基酸螯合钙的主要的优点包括：含钙量高、吸收的效果好、吸收的过程不依赖于维生素D3、吸收进入血液后仍会以螯合钙的形式再转运到细胞中、细胞内的螯合钙的解离受到机体血钙水平的调节，不会对肌肉组织造成损伤、不会发生高血钙症，不会影响磷的吸收。
有专家以氨基酸螯合钙、葡萄糖、次磷酸镁等为原料研发了一种用于围产期奶牛防治低钙血症的新型的口服液。而结果表明，该口服液中富含有大量的氨基酸成分，该氨基酸螯合钙还具有很强的过瘤胃的效果。所以，当该氨基酸螯合钙转运到小肠到后以整体的形式被吸收进入血液。因此不仅补充了钙，还补充了氨基酸，并且间接完成了过瘤胃蛋白的作用。另外，因为氨基酸螫合钙的分子结构是钙离子以及α-氨基酸中羧基的氧原子同a-氨基形成多个稳定的五元环的螯合结构，所以尽管口服液的浓度较高也不会对其造成食道黏膜的损伤，因此无明显的不良反应。
4小结
对现有的奶牛低钙血症的防治方法有许多，但复方氨基酸的螯合钙口服液是如今预防该病的一种普遍应用的方法。而对于产后仍采用硼葡萄糖酸钙的静脉注射或高浓度钙盐的口服来补充血钙。因此相信随着科技的不断进步，一定能开发出一种理想的药物来治疗低钙血症，并根据该方法制订出相应的的防治措施，从而有效降低低钙血症的发生。
良种肉羊体外胚胎高效生产技术的研究
摘要：本研究旨在比较小尾寒羊6周龄、13周龄羔羊、成母羊激素处理后卵巢卵泡发育及体外胚胎发育的影响。通过促卵泡激素（FSH）和孕马血清促性腺激素(PMSG)处理，比较卵巢上2～8mm卵泡的数量及体外胚胎的发育情况。结果表明：6周龄羔羊卵巢发育的卵泡数和采集到的卵母细胞数（58.3±1.7、41.6±3.2）都高于13周龄羔羊及成母羊的卵泡数和卵母细胞数（16.7±2.6、10.5±2.1；19.6±4.5、11.8±1.6），且差异显著(P＜0.05)。6周龄、13周龄羔羊卵母细胞受精后的卵裂率(64.1％±1.5％、63.8％±3.4％)及囊胚率(31.2％±1.9％、30.4％±3.7％)略低于成母羊组(67.4％±3.7％、34.4％±1.2％)，但没有显著差异(P0.05)。
通过外源激素诱导，从羔羊获得大量卵母细胞，受精后进行胚胎移植，能显著提高良种母羊的繁殖潜力、缩短世代间隔，加速遗传改良进程。本研究旨在比较小尾寒羊6周龄、13周龄羔羊、成母羊激素处理后卵巢卵泡发育及对体外胚胎发育的影响。通过促卵泡激素和孕马血清促性腺激素处理，比较卵巢上2～8mm卵泡的数量及体外胚胎的发育情况。
1材料与方法
1.1母羊选择
分别于2016年4、5、6月份，选择体况良好、年龄分别为成母羊、6周龄、13周龄羔羊各9只，共有27只，品种为小尾寒羊。
1.2母羊激素处理方案
成母羊组及羔羊组（6周龄组、13周龄组），分别在第一、二、三天的早6：00、晚18：00时肌肉注射2.5mL、1.5mL、1.0mLFSH(20IU／mL)，并在最后一次注射FSH同时每只羔羊加注0.4mLPMSG(500IU／mL)。
1.3卵母细胞的采集
母羊在注射FSH48h后空腹、术部剪毛，在母羊腹下切一个切口，引出卵巢，用吸有约2mL抽卵液TCM199(5％发情羊血清、100IU／mL肝素、100g／mL链霉素、100IU／mL青霉素)的10mL注射器(接12号针头）吸一个卵巢表面2～8mm的卵泡。在实体显微镜下检出A、B级卵丘-卵母细胞复合体（COCs），记录所采集的COCs数，分别比较成母羊、6周龄、13周龄羔羊卵巢上发育的卵泡数及采集的卵母细胞数。
1.4卵母细胞的体外成熟
将采集到的卵母细胞在38.5℃、5%CO2、饱和湿度培养箱进行24h的成熟培养。培养方式为微滴培养法，滴上覆盖石蜡油。在直径为35mm的细胞培养皿作6～8个滴（100μL/滴），在培养箱预平衡2h。成熟培养液为TCM-199（10％胎牛血清、10μg／mL促卵泡激素、1μg／mL促黄体激素、1μg／mL雌二醇）。
1.5卵母细胞的体外受精
卵母细胞体外成熟24h后，挑选颗粒细胞扩散效果较好的进行受精。受精液为合成输卵管液(syntheticoviductfluid，SOF)并添加20％发情羊血清、10μg／mL肝素、3%牛脱脂血清白蛋白（BSA）。羊冷冻精液在37℃水浴中解冻15s，然后将解冻后的精液缓慢加入5mL精子洗涤液SOF（10%发情羊血清、10μg／mL肝素）混匀后进行离心(1500r／min，5min)，离心沉淀后的精子团再用5mLHSOF离心洗涤(1000r／min，5min)1次。去上清液后，用受精液将精子密度稀释至5×106个／mL用于体外受精。体外成熟的卵母细胞在受精液中洗1～2次，每20个卵母细胞移入50μL受精液滴中。
1.6早期胚胎的体外培养
精子与卵子受精培养24h后在SOF液中洗涤2次后，移入预先在培养箱内平衡2h培养滴内。将20～25枚受精卵分别移入100μL的发育培养液SOF(2％的必需氨基酸、1％的非必需氨基酸、2mmol／L的谷氨酰胺、3mg／mLBSA、10ng/mL上皮生长因子）中，在38.5℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养7～8天。48h统计卵裂率，每隔48h半量更换培养液。第8天，统计囊胚率。
统计分析采用SPSS统计软件@Independent-samplest检验和One-wayANOVA进行方差分析。
2.结果
2..1成母羊、6周龄、13周龄羔羊卵泡数和卵母细胞数比较
由表1可知，6周龄羔羊卵巢发育的卵泡数和采集到的卵母细胞数都远远高于13周龄羔羊及成母羊的卵泡数和卵母细胞数，且差异显著(P0.05)。摘取卵巢组卵母细胞获得率（80%）显著高于活体采卵组（65%）。
2..2羔羊个体差异对激素诱导效果的影响
在本试验中，通过激素诱导羔羊卵泡发育，羔羊之间差异较大。在获卵总数方面，获卵数量小于25枚的有4只，大于45枚的有8只，5只获卵数量在25～45枚之间，1只羔羊没有反应(见表2)。
2..3成母羊、6周龄、13周龄羔羊卵母细胞发育能力及不同取卵方式对体外胚胎发育能力的比较
由表3可见，6周龄、13周龄羔羊卵母细胞受精后的卵裂率及囊胚率与成母羊组没有显著差异（P0.05）。其中成母羊组卵裂率及囊胚率略好于羔羊组。不同的取卵方式对体外胚胎的发育能力影响差异不显著。
3讨论
3.1母羊年龄对卵泡数及卵母细胞数的影响
不同月龄的母羊经外源激素处理后卵巢上发育的卵泡数及卵母细胞数差异很大。6周龄羔羊卵巢上发育的卵泡数及卵母细胞数最多，显著地多于13周龄羔羊及成母羊（P0.05）。于勇等试验证明：1月龄、3月龄羔羊超排处理效果上的差异与血液中FSH水平有关，较高的FSH水平会促进卵巢上卵泡发育。本研究结果也证明了这一结论。
3.2个体差异对激素诱导效果的影响
在本试验中，通过激素诱导母羊卵泡发育，羔羊之间差异较大。在获卵总数方面，获卵数量小于25枚的有4只，大于45枚的有7只，3只获卵数量在25～45枚之间，1只羔羊没有反应。可见，激素诱导羔羊卵泡发育存在较大的个体差异。这个结果与成年母羊的激素诱导效果相似。
3.3母羊年龄及不同取卵方式对卵母细胞体外发育能力的影响
本试验表明，6周龄、13周龄的羔羊所获卵母细胞在体外成熟、体外受精后的桑葚胚和囊胚率接近于成母羊(P0.05)。赵宏远试验证明，30～50日龄组与51～70日龄组所获得卵母细胞体外发育能力差异不大。Morton试验证明，6～7周龄羔羊比3～4周龄羊卵母细胞体外受精后囊胚率高(21.4％VS17.4％)。陈晓勇等报道，羔羊卵母细胞与成年羊卵母细胞体外发育能力是否有差异尚存在争议。Jorio等研究表明，随着年龄增长卵母细胞在体外的发育能力增强，成年羊的卵母细胞发育能力强于羔羊，本试验结果证明羔羊卵母细胞的发育能力略次于成年母羊的。造成此现象的原因除了年龄因素外，也与体外培养体系、个体体况差异等因素有关，但其内在的机理还不是很清楚，需要扩大群体数量进一步研究。
4结论
本试验通过对成母羊及6周龄、13周龄羔羊进行FSH+PMSG外源激素处理，发现6周龄羔羊在激素诱导后卵巢上卵泡数显著高于成母羊及13周龄羔羊，获得的卵母细胞数也远远高于成母羊及13周龄羔羊；获得的卵母细胞经过体外成熟、体外受精、早期胚胎体外培养试验后，6周龄羔羊卵母细胞体外成熟、受精后发育的囊胚率与成母羊及13周龄羔羊结果相近。羊是多胎动物，一个卵巢上可以同时排多个成熟卵子，为了提高卵母细胞获得率，摘除一个卵巢并不会影响母羊以后的繁殖性能。
参考文献:
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鳖卵的收集及受精卵的鉴别方法
1．寻卵穴插标记：在亲鳖产卵季节，应由专人负责寻找卵穴。根据鳖的产卵习性，在黎明前后大都已产完卵离岸回到水中。所以，在日出前到产卵场和产卵沙盘及其周围寻找卵穴。亲鳖刚产卵埋过的卵穴，周围有新鲜沙土及放射状的爪印，卵穴上方经腹甲压实较平整，同时雌鳖自池中爬上爬下留下水湿的痕迹，由此即可确定卵穴的位置。上午8～9时经太阳照射后水湿痕迹就会消失，或者由于刮风下雨将雌鳖产卵的痕迹除掉，所以，一定要把握住寻找卵穴的时机。卵穴确定后要做好标记，以便集中采卵。
卵穴位置确定后不要急于挖卵，因刚产出的鳖卵，卵胚尚未固定，卵的动物极与植物极不易分清，过早的采卵震动影响胚胎发育。鳖卵产出后，应待8～30小时（视气温高低而定），鳖卵两极能够明显地辨别时再行移动。
2．采卵：采卵一般在当天下午5时以后开始。首先按标记将卵穴上层盖土扒去，将卵轻轻取出，再按动物极（卵顶有白点的一端）向上，植物极向下放入采卵箱，采卵箱（或盆）底铺2～5厘米厚的细沙或稻壳，用以固定鳖卵，在箱中排列整齐，注意动物极与植物极不要倒置，鳖卵之间要留空隙，不可堆叠，以免使卵受压，影响胚胎形成。当天的鳖卵采集完毕后。应随即将卵穴填平压实，清理平整后，再适量洒水，保持泥沙湿润。
采卵时注意不要把卵壳碰坏，如有卵壳碰坏的应即拣出。
3．受精卵的鉴别：卵绝大多数呈真球形；极少数呈椭圆形。刚产出的卵洁白，表面平滑，具有光泽。受精卵产出数小时后，卵壳顶上出现一圆形的白色亮斑，并不断扩大成白色的亮区。即是动物极，其胚胎正在发育，卵壳下部呈杏黄色。未受精的卵不出现亮斑，或仅出现亮斑但不再扩大，48小时后整个卵壳失去光泽，显得较粗糙，逐渐变成杏黄色。由于鳖卵是体内受精，只要卵子成熟较好，一般受精率达90％～100％。
由于亲鳖个体大小不同，性成熟的年龄和体质强弱不同，以及环境条件、饲养条件的不同影响，即使同一母体产出的一窝卵，受精率也有差别。所以，一定要注意反复观察每一个卵，是否受精，是未受精或受精发育不良的卵，应予拣出。否则未受精卵在孵化过程中会发生腐败，而影响受精卵的孵化。另外，应及时标记取卵时间，以便按时间分批孵化。